PloS Neglected Tropical Diseases. 16: e0010965.

地球自转导致光照和温度的昼夜变化使生物体具有不同的生理和行为活动节律，这些节律是由基因编码的生物钟所调节和维持。在黑腹果蝇中已证实，核心时钟基因“时钟”（clock）和“循环”（cycle）的表达产物可作为正向调控因子激活其他核心时钟基因例如“周期”（period）和“永恒”（timeless）的转录，而period和timeless的表达产物可作为负向调控因子反过来抑制clock介导的转录[1]。由这些核心时钟基因组成的转录翻译反馈环是生物钟的关键分子基础。生物钟可以对环境因子做出反应，使生物体产生行为活动的昼夜节律。

交配是关乎物种繁衍的重要行为活动，在昆虫中交配行为常常表现出昼夜节律，例如，在12h光照：12h黑暗周期下黑腹果蝇的交配活动主要在白天[2]。然而对于白纹伊蚊和致倦库蚊这两种重要媒介蚊虫的交配节律模式及其调节机制尚不清楚。

白纹伊蚊是一种白天活动的蚊虫，是登革热、寨卡病毒病和基孔肯雅热的重要传播媒介[3-4]。致倦库蚊是一种夜间活动的蚊虫，可传播丝虫病和日本脑炎[5-6]。当前，依赖于操纵或利用交配行为的蚊媒防控策略，例如昆虫不育技术(SIT)[7]，正迅速成为控制蚊媒种群的重要手段。深入了解白纹伊蚊和致倦库蚊交配行为的时间特征及其调控机制，可能会为蚊媒防控策略提供新的见解。

2022年12月13日，南方医科大学热带医学研究所陈晓光教授团队等在国际学术期刊PLOS Neglected Tropical Diseases（PLoS NTD）上在线发表了题为“Clock genes regulate mating activity rhythms in the vector mosquitoes, Aedes albopictusand Culex quinquefasciatus”的文章。该研究基于CRISPR/Cas9技术在白纹伊蚊和致倦库蚊中建立了核心时钟基因clock的敲除品系，并揭示了时钟基因clock在这两种蚊虫所呈现的不同交配节律中所发挥的重要作用，其在光照黑暗周期下可调节desat1基因的时间表达，进而影响性信息素合成和交配活动。该研究成果为控制重要媒介蚊虫白纹伊蚊和致倦库蚊提供了科学指引。

将羽化后2-3天且未交配的白纹伊蚊和致倦库蚊雌雄蚊分别置于光照黑暗周期（12h：12h，LD）同步，从LD条件下第四天的ZT0（8:00 am）开始，以10只雄蚊和10只雌蚊为一组并交配3小时，随后用另一组雌雄蚊进行下一个时间段的交配实验，评价一天中不同时间段的蚊虫交配率（图1A）。结果显示，在光照黑暗周期下，白纹伊蚊在全天各时段均有交配活动但以白天为主，其交配呈现双高峰，主要在光照后3h（ZT0-3）和黑暗前3h（ZT9-12），而致倦库蚊主要在夜间有交配活动，其交配高峰仅出现在黑暗后3h（ZT12-15）。在恒定黑暗（DD）条件下，白纹伊蚊和致倦库蚊交配活动仍具有节律性振荡，它们的交配高峰时间相位没有明显改变，说明即使没有外界光照的刺激，白纹伊蚊和致倦库蚊的交配活动仍表现出节律性振荡，交配行为受内源性生物钟调控（图1B和1D）。为了确定交配行为是否能被光照同步，将原本光照开始的时间点设置为黑暗（ZT0关灯），而原本黑暗开始的时间设置为光照（ZT12开灯），使光照黑暗的时间相互颠倒（DL），结果显示白纹伊蚊的交配高峰依然是在光照后3h（ZT12-15）和黑暗前3h（ZT21-24），而致倦库蚊在开灯后各时间点几乎没有交配，依然只有在黑暗后3h (ZT0-3)有交配高峰。为了验证将光暗条件颠倒以后呈现的交配节律是否由于对光线的应激反应，将DL同步以后的蚊虫继续放在DD条件下至第二天，再次检测其交配节律，结果发现DD条件下两种蚊虫的交配节律与DL的交配节律趋势相似，进一步说明了交配节律可以被外界的光暗循环所同步（图1C和1E），而不是对光线的应激反应。上述结果表明，白纹伊蚊和致倦库蚊具有截然不同的交配节律，白纹伊蚊偏好于白天交配，致倦库蚊偏好于夜间交配（图1F），它们具有不同的交配高峰时间，并且两种蚊虫的交配节律均受到内源性生物钟的调控并能被光暗循环准确同步。

为了确定核心时钟基因是否参与调控白纹伊蚊和致倦库蚊的交配节律，利用CRISPR-Cas9技术分别敲除白纹伊蚊和致倦库蚊核心时钟基因clock（clk）, 并构建clk敲除的纯合品系Aalclk^Δ293和 Cxqclk^Δ98（图2A和2F）。sgRNA 目标位点位于白纹伊蚊的外显子 2 和致倦库蚊的外显子 3。白纹伊蚊纯合突变品系 Aalclk^Δ293具有 293 个碱基对 (bp) 的缺失和 76bp 的插入，而库蚊 Cxqclk^Δ98纯合突变品系具有 98bp 的缺失和 8bp 的插入，两者均导致相应靶基因的移码突变。在光暗循环下使用qRT-PCR检测Aalclk^Δ293、Cxqclk^Δ98和野生型(WT;Aalclk⁺和Cxqclk⁺)中clock基因的表达水平。结果显示，在WT对照中，两种蚊虫的mRNA丰度水平均出现振荡，而clk敲除品系的mRNA水平在一天中均表现出显著降低（图2B-C和2G-H）。对白纹伊蚊和致倦库蚊clk敲除品系分别进行LD条件下一天中各个时间段的交配节律实验，结果显示在白纹伊蚊Aalclk^Δ293敲除品系中，白天各时间点的交配率依然高于夜间各时间点的交配率，但交配高峰与WT组相比表现出峰值相位往夜间延迟3h的现象，观察到黑暗后3h（ZT12-15）有较高的交配率，计算白纹伊蚊Aalclk^Δ293在白天和夜间的总交配率发现其在夜间的交配率显著高于野生型（WT）（图2D-E）。而致倦库蚊Cxqclk^Δ98在白天各时间点均有交配活动，反而在夜间没有交配，其夜间交配高峰消失，clk基因突变以后导致致倦库蚊的交配行为发生了显著的相位改变，计算致倦库蚊Cxqclk^Δ98在白天和夜间的总交配率发现其在夜间的总交配率显著低于WT（图2I-J）。上述研究结果说明在LD条件下，核心时钟基因clk参与调控白纹伊蚊和致倦库蚊的交配行为节律。

在昆虫中，表皮碳氢化合物(Cuticular hydrocarbons，CHCs) 在性交流过程中被广泛用作接触性信息素[8-9]。最近的一项研究表明，desat1基因参与了冈比亚按蚊和斯氏按蚊信息素的合成，并影响了交配行为[10]。然而，CHCs和desat1基因在白纹伊蚊和致倦库蚊中的功能尚不清楚。在两种活动模式截然不同的蚊种（昼行性白纹伊蚊和夜行性致倦库蚊）中，分别取在LD条件下同步了第四天雌雄蚊的头部组织检测desat1基因的时间表达谱发现，desat1在白纹伊蚊和致倦库蚊各组织中一天中都表现为明显的振荡表达，但白纹伊蚊和致倦库蚊的振荡趋势相反，白纹伊蚊在开灯后和关灯后各有一个表达高峰，而致倦库蚊仅在光照向黑暗转换时段有表达高峰。分别检测白纹伊蚊和致倦库蚊clk基因敲除品系LD条件下desat1的时间表达谱，结果发现与WT相比，两种蚊虫的雄蚊desat1基因表达发生了与交配节律相似的时间相位变化（图3A和3C），相反，与WT对照相比，敲除品系雌性的desat1表达谱仅发生振幅变化，在时间表达趋势上没有明显的相位改变（图3B和3D）。研究结果说明白纹伊蚊和致倦库蚊中核心时钟基因clk参与调控各自desat1基因的时间表达。

用胸腔注射desat1双链RNA的方法分别抑制雌雄蚊desat1基因的表达，在两种蚊虫desat1沉默效率最高的第四天（图3E-F）取雌雄蚊各30只交配24h（图3G），并以注射GFP dsRNA 作为阴性对照比较交配率。结果发现敲低两种雄蚊的desat1基因会导致交配率显著降低（图3H-I），而敲低两种雌蚊的desat1基因对交配率没有显著影响。进一步比较抑制雄蚊desat1基因表达后白纹伊蚊和致倦库蚊一天内各个时间点的交配节律发现，白纹伊蚊整体的交配节律没有明显改变，但是各个时间点的交配率均下降，其中在ZT0-3和ZT9-12较为明显，而致倦库蚊敲低desat1后导致ZT12-15和ZT15-18的交配率显著下降，但整体交配节律也没有明显改变（图3J-K）。最近的研究表明，在群舞的按蚊雄蚊中， desat1基因表达上调，并调节CHCs的生成[10]，根据雄蚊在蚊虫交配系统中起到交配发起者的作用[11]，结合本研究结果，作者认为desat1在两种蚊虫雄蚊体内CHCs的合成和交配活动中起重要作用，虽然desat1基因不影响交配节律，但可能作为下游基因影响交配行为。

接下来分别对注射desat1 dsRNA第四天的白纹伊蚊和致倦库蚊雄蚊提取CHCs，以注射GFP dsRNA为阴性对照，使用气相色谱/质谱联用技术进行定性和定量分析（图4A-B），结果发现，desat1敲低以后，在白纹伊蚊中，C19、C23、C29和C31这几种烷烃显著降低，只有C27升高（图4C）, 而在致倦库蚊中，C21、C23显著降低，C27、C29的则显著升高（图4D），敲低desat1基因会导致白纹伊蚊和致倦库蚊的碳氢化合物组分含量发生明显改变。将上述有差异的CHCs涂抹到雄蚊腹部[10]，将20只处理后雄蚊与20只未交配雌蚊进行交配测试（图4E），结果显示涂抹了C19和C23的白纹伊蚊雄蚊能显著提高蚊虫交配率，涂抹了C27会降低交配率（图4F），而涂抹了C29和C31没有明显改变。在致倦库蚊中，涂抹了C23的雄蚊能显著提高交配率（图4G），而其他则并没有显著改变。