PLoS Neglected Tropical Diseases. 18(11): e0012674
Aedes albopictus (Asian Tiger mosquito) relies on vision to select oviposition sites, favoring small, dark containers during twilight hours. To understand the underlying mechanisms, we blindfolded female mosquitoes and screened their transcriptomes, identifying rho-l and kh genes as potential vision-related factors. Gene editing experiments provided crucial insights into the roles of rho-l and kh in Ae. albopictus oviposition behavior. Mutants lacking functional rho-l (rho-l4807) exhibited a significant decrease in their sensitivity to long-wavelength red light, leading to a reduced ability to locate preferred oviposition sites. Similarly, khw mutants displayed a decreased ability to respond to variations in daily brightness, as well as a reduced capacity to discriminate between different colors. This impaired color discrimination and sensitivity to brightness changes directly affected their ability to identify preferred oviposition sites. These findings highlight the crucial role of rho-l and kh in mosquito visual-mediated oviposition site selection, providing valuable insights into mosquito behavior and potential targets for vector control.
2024年11月27日，南方医科大学热带医学研究所陈晓光教授团队在国际学术期刊PLOS Neglected Tropical Diseases上在线发表了题为“Vision guides the twilight search for oviposition sites of the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus”的文章。研究揭示白纹伊蚊黄昏时光产卵的视觉机制。
该研究通过建立复眼涂抹处理组与正常组搜寻产卵地模型，揭示了以复眼介导的视觉在搜寻产卵地过程中发挥了重要作用，继而通过筛选与视觉相关的差显基因及其功能分析，证明Rho-l和Kh基因是白纹伊蚊黄昏时光搜寻产卵地过程中的关键视觉基因，这些发现为白纹伊蚊孳生地的防控奠定了基础。流程图如下（图1）：
蚊虫的复眼是接受外界光的主要器官，介导的光通路对蚊虫的生理活动有重要影响。作者为了验证视觉因素是否影响白纹伊蚊搜寻容器型小积水，使用了丙烯酸颜料涂抹蚊虫复眼以遮蔽光线进入[19, 20]（图3a）。实验前使用了阴影实验测试涂抹复眼是否有效，结果显示涂抹复眼有效遮蔽了进光量，阻碍了蚊虫对于光线的感知（图2）。
图2. 复眼正常组与涂抹组阴影指数比较
作者为了探究涂抹复眼是否影响蚊虫寻找产卵地，建立了实验室条件下的搜寻模型（图 3a）。复眼涂抹与未涂抹组蚊虫的测试结果显示，涂抹复眼组相比未涂抹组搜寻容器型小积水的能力下降（图 3b），表明遮蔽以复眼介导的光通路影响了白纹伊蚊搜寻产卵地的过程。
为了探究遮蔽复眼后搜寻产卵地过程中相关的视觉基因，作者进行了复眼遮蔽与未遮蔽蚊虫的转录组对比分析，发现遮蔽蚊虫多个基因表达下调，其中rho-l基因下调幅度最大，RT-qPCR验证结果与之一致（图3c和3d）。同时，作为色素细胞合成关键基因的kh基因表达量也显著下降。这表明Rho-l和kh基因可能参与复眼介导的光信号通路（图3d）。
图3.复眼在白纹伊蚊搜寻产卵地过程中发挥重要作用
作者利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除rho-l基因，rho-l突变品系共807bp删失（图4a），其结构功能域受到较大的破坏（图4b）。同时，Rho-l△807品系寻找产卵地的能力较野生型下降（图4d），说明rho-l基因在白纹伊蚊搜寻产卵地的视觉过程中起了重要作用。
作者进一步通过光照强度、容器颜色和单色光等实验，探究rho-l基因对白纹伊蚊寻找产卵地行为（在不同光照条件下，如正午、黄昏和夜晚）及颜色和光谱识别的影响。结果显示白纹伊蚊寻找产卵地受光照影响，最佳光照条件接近黄昏(约130lux)。Rho-l△807品系在不同光照强度下诱捕数量均显著低于野生型，尤其在130lux时下降幅度最大（图4e）。这表明rho-l基因在白纹伊蚊黄昏时段寻找产卵地的视觉过程中起关键作用。 白纹伊蚊偏好的产卵地是深色的小容器型积水， rho-l基因是否参与了颜色的识别尤其是深色容器呢？作者进行了黑色与其他颜色的双向诱卵实验。结果显示，野生型白纹伊蚊更偏好黑色产卵容器，但不同颜色容器间差异无统计学意义。Rho-l△807品系对黑色与其他颜色（白、蓝、绿、黄）容器的选择与野生型无显著差异（图4f），但对红色容器的选择差异显著（图4f）。这表明rho-l基因可能参与了白纹伊蚊对红色容器的识别。 为了探究蚊虫在黄昏寻找产卵地的光谱因素以及Rho-l△807品系在黑红容器识别中诱卵指数的差异原因，作者使用了常见的长、中、短波长为代表的红色（中心波长630nm）、绿色（中心波长520nm）、蓝色（中心波长460nm）的LED灯进行诱捕实验。结果显示，在红光下，野生型和Rho-l△807品系数目差异显著；但在蓝光和绿光下，两者差异不显著。这证实rho-l基因参与了白纹伊蚊对红色光谱的识别，与之前黑色和红色容器实验结果一致，因为红色物体反射较多红光[23]。综上所述，rho-l主要识别长波段的红光。而黄昏时段光线的特点是光照度较弱、长波长的红光分布较多，因此rho-l是白纹伊蚊在黄昏搜寻产卵地的重要视觉基因。
复眼中小眼的色素细胞是蚊虫完成光传导的重要组成部分，色素细胞中色素负责调控小眼的进光量，而kh基因在色素合成中起关键作用。
作者实验室前期已经成功构建kh基因的敲除品系（图5a）[24]。khw突变纯合子复眼表型为白色（图5b）。实验结果显示，kh基因敲除影响了白纹伊蚊寻找产卵地以及光照度的调节（图5c）。接着，作者应用双向选择试验研究了kh基因是否参与了容器颜色的识别过程。不同颜色产卵杯的诱卵指数越趋向于-1，则说明孕蚊越倾向于黑色的产卵杯。结果显示，与野生型相比，khw对黑色与白、绿色容器的选择差异显著，而对黑色与蓝、黄、红色容器的选择差异不显著（图5e）。这表明kh基因可能参与了白纹伊蚊对白色和绿色容器的识别。综上，kh基因合成色素，影响光线筛选和进光量，本研究结果提示其可能参与了白纹伊蚊对白色和绿色，以及黑白、黑绿颜色对比的识别。
作者在蓝、绿、红色LED灯诱捕实验中， 发现khw飞入诱卵器的数量均显著低于野生型（图5f）。表明kh基因参与了对红、绿、蓝三种光谱的识别。综上所述，复眼的kh基因在白纹伊蚊黄昏时分寻找黑色产卵容器的过程中，对光照强度和颜色识别至关重要。
图5. Kh基因在搜寻产卵地过程中的作用与机制
图6. 总结图
作者通过建立白纹伊蚊搜寻产卵地模型，遮蔽蚊虫的复眼，观察其对搜寻产卵地的影响。继而通过对遮蔽复眼与未遮蔽复眼蚊虫的转录组测序对比分析，筛选在搜寻产卵地过程中差显表达的视觉基因。进一步利用CRISPR//Cas9技术建立差显基因rho-l和kh的敲除品系，并设置不同光照度诱捕实验、不同产卵杯颜色的双向选择实验、不同单色光（蓝光、绿光、红光）诱捕实验探究其在搜寻产卵地中的作用和机制。
该研究揭示了白纹伊蚊寻找产卵地的视觉作用，阐明了白纹伊蚊偏好黄昏时寻找容器型小积水产卵的分子机制，为白纹伊蚊孳生地治理提供了理论基础和科学指引。
